Al secondo piano nobile trovano collocazione alcuni dei fondi più corposi della biblioteca, fra i quali il fondo Villarosa e il fondo San Martino, nonchè le raccolte iconografiche della biblioteca Lucchesi Palli, della raccolta Palatina e del fondo Aosta. Nelle sale dedicate a quest'ultimo, troviamo non solo la collezione privata della Duchessa d'Aosta, di notevole interesse per la varietà di materiale conservato che va dal libro alle fotografie agli animali tassidermizzati ed oggetti tribali, ma anche la biblioteca personale della direttrice Guerriera Guerrieri, comprensiva del suo arredo originale. Un'intera ala del secondo piano ospital'Officina dei Papiri Ercolanesi, entrata a far parte della Biblioteca Nazionale a partire dal 1910.
Dal punto di vista artistico, di notevole interesse sono le Sale pompeiane, chiamate in questo modo perché caratterizzate dagli affreschi dallo stile tipicamente pompeiano. Importanti sono gli affreschi che decorano l'ultima sala del fondo Aosta, realizzati nel XIX secolo dal pittore Camillo Guerra e che rappresento le Storie di Carlo d'Angiò.

• Lucchesi Palli
• Sala pompeiana
• Sala Palatina
• Fondo Aosta
• Officina dei Papiri Ercolanesi