La sezione Manoscritti si configura come un lungo corridoio che si snoda parallelamente al Reference e ad una delle Sale di Consultazione. Gli ambienti da essa occupati hanno affaccio diretto sul Maschio Angioino e sul giardino e ospitavano un tempo l'appartamento privato dei sovrani, funzione ancora oggi intuibile grazie alla presenza di una cappella, oratorio privato dei reali. Questi ambienti sono oggi arredati con imponenti scaffalature in legno di mogano provenienti dalla Reale Biblioteca Borbonica. Le scaffalature in mogano con fregi in bronzo dorato collocati nella sala di lettura della sezione provengono invece dalla Biblioteca San Giacomo.
Per quel che concerne il patrimonio librario, il nucleo originario della sezione Manoscritti coincide con una parte di quella collezione farnesiana portata a Napoli da Carlo di Borbone nel 1734. Ad essa si aggiunsero, nel tempo, i manoscritti del principe di Tarsia, quelli provenienti dalle raccolte dei gesuiti e di altri ordini soppressi e i codici appartenuti al vescovo di Troia.
La sezione custodisce opere di gran pregio che testimoniano e documentano la storia della cultura dai primi secoli dopo Cristo fino ai nostri giorni. Tra il materiale di maggior valore spiccano il Libro d'ore di Alfonso d'Aragona e il Breviario del figlio Ferrante; il più antico testimone miniato delle Metamorfosi di Ovidio; il codice Flora, libro d'oro con decorazioni fitomorfe; la cosmographia del Tolomeo con un'immagine del mondo allora noto; la Carta Catalana risalente al XV secoli; il codice di Discoride testimone della farmacopea del VI secolo d.C.; il codice di mano di San Tommaso d'Aquino; scritti di Tasso, Vico, Leopardi, De Sanctis, Croce e Ungaretti.